뽀닥사의 실험노트

Plant DNA minipreparation : Plant genomic DNA mini-prep for PCR reaction (=Preparation of total Arabidopsis DNA) 1. 시약 Lysis buffer (100ml)50mM Tris (2M Tris (pH 7.6) , 2.5ml)100mM NaCl (5M NaCl , 2ml)50mM EDTA (0.5M EDTA , 10ml)83ml ddH2O첨가Autoclave 121도, 15분간0.5% SDS (20% SDS , 2.5ml)10mM [beta]-mercaptoethanol(BME) (14.26M BME, 70.1[mu]l) TEN buffer(100ml)10mM Tris (2M Tris(pH 8.0), 0.5ml)1m..

E.coli competent cell 제조 및 형질전환 Transformation(형질전환)이란? DNA를 bacteria 세포 내로 주입하는 과정으로 Prokaryote와 eukaryote에서는 DNA를 세포 내로 주입할 때 다음과 같이 조금 다른 용어를 사용한다.Cell DNA Term: Prokaryote Plasmid TransformationBacteriophage (virus) Infection Eukaryote Plasmid TransfectionVirus vector Transfection 이 실험에서는 prokaryote인 E.coli를 사용하므로 transformation이라 한다. Competent cell이란? 정상적인 bacteria에 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 ..

Real-Time PCR(SolGent)PCR이란? PCR(중합효소 연쇄반응, Polymerase Chain Reaction)은 DNA의 원하는 부분을 복제, 증폭시켜 특정 DNA 서열의 양을 추정하는 분자생물학적인 기술입니다.미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있습니다.여러가지 기술은 분자생물학, 의료, 범죄 수사, 생물의 분류 등 DNA를 취급하는 작업 전반에서 중요한 역할을 담당하고 있습니다.Real-Time PCR이란? 분자생물학에서 PCR을 기반으로 한 실험방법으로, 실시간 PCR 또는 정량중합효소연쇄반응 이라고도 합니다.일반 PCR의 경우 반응이 완료된 후 최종 산물의 양을 알 수 있는 반면에, Real-Time PCR은 PCR이 진행하는 동안 ..

Plant RNA extraction 1. sample은 액체질소에 얼린 후, 막자사발에 갈아 미리 powder 상태로 준비2. e-tube에 Trizol 1ml 씩 분주해 놓는다.3. powder가 뚜껑에 닫힐 정도로 가득 채운 후 열어둔다(sample이 터질 위험있음)4. vortexing 10min, 4℃ centrifuge 12000rpm 10min5. new tube에 1ml을 옮긴다.6. chloroform 250ul 를 더해 vortex 10min, 4℃ centrifuge 12000rpm 10min7. 상등액(600~650ul) 취하고 IPA를 80% add, mix8. 4℃ centrifuge 12000rpm 15min9. pellet을 확인하고, 70% DEPC-EtOH로 wash 1m..

Random Primer DNA Labeling Kit(TAKARA)cat.#6045 v0802 Takara [α-32P], [3H]dCTP로 DNA를 표식하여 hybridization용 DNA 프로브를 제작하는 키트이다. Feinberg와 Vogelstein의 방법을 개량하여 간단한 조작으로 높은 비방사활성의 DNA 프로브를 제작할 수 있다.또 Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2는 3’→ 5’exonuclease 활성을 제거한 Exo-free Klenow Fragment와 Random Primer (9 mer)를 조합하여 표식하므로써 1×109dpm/㎍의 높은 비방사활성 프로브를 단시간 (10분 이내)에 제작할 수 있다. 시약Random Primer (9mer)10x Bu..

cDNA란, complementary DNA의 약자로, 상보적 DNA라고 합니다. 이는 mRNA(전령 RNA)로부터 역전사 효소(reverse transcriptase)를 이용해 합성한 DNA입니다.DNA는 두 종류(단백질 합성 코드를 가지고 있는 엑손(exon), 가지고 있지 않은 인트론(intron))의 서열로 이루어져 있는데, cDNA는 인트론(intron)이 존재하지 않는 DNA서열입니다. 즉, 단백질 합성에 필요한 정보만을 가진 DNA서열입니다. 왜 cDNA를 만들까?mRNA는 세포에서 단백질을 만들기 위한 유전 정보만을 포함하고 있지만, RNA는 불안정하고 실험에 사용하기 어려워서, 안정적인 형태의DNA로 바꾸어 사용합니다. 바로 이때 만드는 것이 cDNA입니다. ice, PCR machine..

RNA prep from Chlamydomonas 1x10^8 cell 준비(cell 상태가 중요함)seed culture 후 2-3일 배양한 cell 사용 1. Take the tube out of the liquid nitrogen and immediately add 1ml of Trizol to the frozen pellet colse the tube and vortex for 10min (Ensure that there is complete mixing). Incubate the homogenized sample for another 5min at room temperature to permit the complete dissociation of nucleoproitein complexes. C..

T-Blunt PCR Cloning Kit(SolGent) Cat. No. SOT01-K020 & TOPcloner TA-Blunt core kit(enzynomics) Cat. EZ017M Taq 뿐만 아니라 Pfu DNA polymerase에 의해 증폭된 모든 PCR 산물의 빠른 cloning에 적합, Topoisomerase I 의 활성에 의하여 상온에서 5분 안에 cloning이 가능한 제품. viable selection system을 도입하여 PCR 산물이 cloning 된 경우에만 colony가 자랄 수 있어 vector self-ligation에 의한 colony의 생성을 원천적으로 막아줌 1. Ligations Using T-Blunt vectors and the 6X T-Blunt bu..

ligation pGEM-T Easy vector(Promega) 1. reagent- 2x Rapid Ligation Bo, T4 DNA ligase : 5ul- pGEM-T Easy vector(50ng) : 1ul- insert DNA : 3ul (양에 따라서 16ng/ul 일때 3ul 넣음)- T4 DNA Ligase(3 Weiss units/ul) 1ul- Deionized water to a final volume of : 10ul16℃ O/N 2. E.coli transformation- competent cell(BIOFACT cat.no.SOT41-K020) ice에 녹일 것, ligate도 같이 ice에 놓을 것, incubate 미리 켜놓을 것 42℃- ligate mixing (pe..

Agarose Gel Extraction kit (INTRON) 준비: incubate 55℃, Elution Bo 같이 넣음 PCR로 증폭시킨 PCR product를 agarose gel에 로딩 시킴※agarose gel을 만들 때 긴 wall인 comb를 준비함 1. agarose gel에 로딩하여 원하는 위치의 band를 자름(최대한 잘게) 2. e-tube 무게 잰 후, gel 무게 확인 3. gel 무게의 3배 Lysis Bo 넣고 vortexing 4. 55℃ 10min 2~3min 마다 mix vortexing(손으로 흔들어줘도 됨) 5. 살짝 down 6. column에 넣고 centrifuging 13000rpm x 1min (양이 많으면 나눠서 돌림 한번에 700ul까지만) 7. Was..