E.coli competent cell 제조 및 형질전환
Transformation(형질전환)이란?
DNA를 bacteria 세포 내로 주입하는 과정으로 Prokaryote와 eukaryote에서는 DNA를 세포 내로 주입할 때 다음과 같이 조금 다른 용어를 사용한다.
Cell DNA Term:
Prokaryote Plasmid Transformation
Bacteriophage (virus) Infection
Eukaryote Plasmid Transfection
Virus vector Transfection
이 실험에서는 prokaryote인 E.coli를 사용하므로 transformation이라 한다.
Competent cell이란?
정상적인 bacteria에 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 있게 만든 cell을 의미한다. 화학처리에 쓰이는 시약에는 Calcium Chloride, Manganase Chloride, Hexamminecobalt Chloride, Dimethyl Sulfoxide (DMSO)가 있다.
Competent cell을 이용한 transformation의 과정은 CaCl2로 처리하여 competent cell로 만들면 plasmid가 cell에 들어갈 수 있게 되고 Heat shock을 가해 plasmid가 cell 안으로 들어가는 효율을 증가시킨다.
형질전환 배지 만들기
1) 아래 배지 조성에 맞춰 배지는 액체로 사용하기도 하는데, 이를 이용한 plate를 만드는 경우 autoclave를 하기 전에 최종 농도 1.5%가 되도록 agar powder (15 g/liter)를 첨가한다.
2) 15 lb/sq로 20분 이상 autoclave한다.
3) 배지가 적당히 (65°C 정도) 식을 때까지 기다린 후 필요하면 ampicillin을 60 ㎍/㎖가 되도록 첨가하고 잘 흔들어 섞는다.
* Ampicillin은 가루를 증류수에 녹여 50～100 ㎎/㎖의 농도로 만들고 filter 후 1 ㎖ 씩 분주하여 -20°C에 보관한다.
4) 배지를 petridish에 조심스럽게 붓고 기포가 생기면 달구어진 loop를 이용하여 제거한다. 하루정도 상온에 놓아둔 후 wrap으로 잘 싸서 4°C에 뒤집어서 보관한다.
* 배지의 온도가 너무 높으면 ampicillin의 활성이 떨어지고, 배지가 너무 식으면 plate를 제 조하는 도중 배지가 굳을 가능성이 있으므로 적당한 온도에서 작업할 수 있도록 한다.
(1) LB 배지 (Luria-Bertani medium) 1 liter
bacto-tryptone 10 g
bacto-yeast extract 5 g
NaCl 10 g
* 실험실에서 가장 흔히 사용되는 배지로 위 성분을 950 ㎖의 증류수에 녹인 후 pH 7로 맞 추기 위해 5 N NaOH를 첨가 (약 200 ㎕)하고 증류수로 1 liter 채운 다음 autoclave한다.
(2) SOB 배지1 liter
bacto-tryptone 20 g
bacto-yeast extract 5 g
NaCl 0.5 g
* Competent cell 제조 시에 사용하는 배지이다. 950 ㎖의 증류수에 녹인 후 250 mM KCl 10 ㎖를 첨가하고 5 N NaOH를 이용하여 pH를 7로 맞춘 다음 증류수로 1 liter까지 채 우고 autoclave한다. 사용하기 직전에 멸균한 2 M MgCl2를 최종농도 20 mM이 되도록 첨가하여 사용한다.
(3) SOC 배지 (Terrific Broth)
* 20 mM의 MgCl2가 함유된 SOB 배지에 20 mM glucose가 첨가된 배지이다. 1 M glucose 용액은 100 ㎖에 18 g의 glucose를 녹여 0.22 ㎛-pore의 filter를 통과시켜 사용 한다. 박테리아의 형질전환 시에 사용한다.
Calcium chloride를 이용한 competent cell 만들기
이 방법은 Cohen등에 의해 개발된 방법을 약간 변형시킨 것으로 대략 10^7 transformed colonies/㎍ of supercoiled DNA의 효율을 가지며 간편하여 실험실에서 많이 사용되는 방법이다. 이 방법으로 만든 competent cell은 시간이 오래 지날수록 형질전환 효율이 다소 감소하긴 하지만 -70°C deep freezer에 보관하여 사용할 수 있다.
실험방법
1) 일주일이내 LB plate에 배양된 E. coli (DH5α, XL-1 Blue, XL-2 Blue, Top 10, JM 109, etc) single colony를 LB broth 2 ㎖에 접종한 후 밤새 (o/n) 키운다.
2) 위에서 키운 배양액 1 ㎖을 100 ㎖ LB 배지가 담긴 플라스크에 넣고 O.D.600이 0.38이 될 때까지 37°C shaking incubator에서 키운다.
* O.D.600이 0.4이상 배양된 경우 transformation efficiency가 매우 낮다.
3) 배양액을 50 ㎖ conical tube에 40 ㎖ 넣고 얼음에 10분간 놓아둔다.
4) 4°C에서 5,000 rpm으로 5분간 원심분리 한다.
5) 상층액을 완전히 제거한 후 cell pellet을 미리 차게 해 둔 0.1 M filtered CaCl2 용액을 원래의 1/2부피로 (20 ㎖) 넣고 현탁 시킨다.
6) 얼음에 30분 놓아두었다가 다시 4°C에서 4,000 rpm으로 5분간 원심분리 한다.
7) 상층액을 버리고 처음의 1/10 부피 (4 ㎖)의 filtered CaCl2 용액 + 20% (v/v) glycerol 로 현탁 시킨다.
8) 미리 차게 해둔 microfuge tube에 100 ㎕ 씩 분주하고, 사용 할 때까지 deep freezer에 보관한다.
박테리아의 형질전환이란?
plasmid DNA를 세포 내로 넣어주는 작업을 말한다. 형질전환은 가능한 한 효율적인 방법을 찾는 것이 중요한데 Large DNA는 small DNA보다 형질전환 효율이 떨어지며 DNA의 양이 너무 많아도 좋지 않으므로 적당한 길이와 적당한 양의 DNA를 사용하는 것이 중요한 요소이다.
실험방법
1) -70°C deep freezer에 100 ㎕ 씩 보관된 competent cell tube 하나를 꺼내어 손바닥에 쥐고 있으면 cell 용액이 녹기 시작한다. Cell 용액이 다 녹으면 곧바로 얼음에 넣어둔다.
2) 10 ㎕ 이하의 DNA를 100 ㎕ competent cell에 넣고 tube를 4～5번 기울이거나 가볍게 손끝으로 쳐서 부드럽게 섞는다. * DNA 용액은 competent cell 부피의 5%를 넘지 않는 것이 좋다. DNA의 양이 많다고 효 율이 점점 증가하지는 않는다.
3) 얼음에 30분 동안 둔다.
4) 42°C 에서 90초간 heat shock을 준다.
5) 얼음에 2～3분 두었다가 LB 또는 SOC 배지 (SOB 배지에 20 mM glucose 함유) 800㎕를 넣고 잘 섞은 후, 37°C 에서 45분간 진탕배양 한다.
6) 미리 37°C에 두었던 LB (with ampicillin) plate에 위 혼합액을 적당량 pipette으로 떨어뜨린 후, spreader로 골고루 펴준다.
※ LacZ 유전자를 이용한 color selection을 하는 경우, 배지에 isopropylthio-β -D-galactoside (IPTG)와 X-gal을 첨가해주어야 한다. X-gal (50 ㎎/㎖) 20～40 ㎕와 IPTG (839 mM) 5～10 ㎕를 미세원침관에서 섞어 배지 위에 떨어뜨리고 밀대로 골고 루 펴주면 되는데, 37°C에 적어도 10분 두었다가 박테리아를 도말 하도록 한다. X-gal 은 50㎎/㎖의 농도로 dimethylformamide (DMF)에 녹여 빛이 차단된 용기에 담아 -20°C에 보관하고, IPTG는 2 g을 증류수에 녹여 10 ㎖ 까지 채운다음 0.22 ㎛-filter하 여 1 ㎖씩 나누어 -20°C에 보관한다.
7) 37°C 배양기에서 plate를 뒤집어서 밤새 배양한다. 12～16시간이면 colony를 관찰할 수 있다.
