Plant DNA minipreparation : Plant genomic DNA mini-prep for PCR reaction (=Preparation of total Arabidopsis DNA)
1. 시약
Lysis buffer (100ml)
50mM Tris (2M Tris (pH 7.6) , 2.5ml)
100mM NaCl (5M NaCl , 2ml)
50mM EDTA (0.5M EDTA , 10ml)
83ml ddH2O첨가
Autoclave 121도, 15분간
0.5% SDS (20% SDS , 2.5ml)
10mM [beta]-mercaptoethanol(BME) (14.26M BME, 70.1[mu]l)
TEN buffer(100ml)
10mM Tris (2M Tris(pH 8.0), 0.5ml)
1mM EDTA (0.5M EDTA, 0.2ml)
100mM NaCl (5M NaCl, 2ml)
89.3ml ddH2O첨가
Autoclave 121도, 15분간
2. 주의 사항
1) Sample을 완전히 가는 것이 제일 중요함.
2) 실험 과정 3) 과 12)는 4도 에서 하는 것도 좋다.
3) 과정 10)에서는 양보다 질을 중시할 것
4) sample 400mg까지는 1 tube에서 처리가능
5) sample양이 많지 않은 경우에는 과정 13) 대신 2)에서 RNase 처리할 것
3. 실험방법
1) 100~200mg 잎조직을 1.5ml E-tube에서(LN2 상태에서)간다.
2) 1.2ml의 lysis buffer 넣고 잘 섞는다. 상온에서 1~2 시간 둔다.
3) 12000rpm 15분간 원심분리
4) 1.2ml의 상층액을 2ml tube에 옮긴다.
5) 300[mu]l의 phenol (pH 7.5~8)을 넣고 10초간 잘 흔들어 섞는다. 상온에서 2분간 둔다.
6) 300[mu]l chloroform 넣어 잘 섞는다.
7) 12000rpm 3분간 원심분리
8) 1.1ml 상층액을 2ml tube에 옮기고 phenol/chloroform추출을 한번 더 실시한 후 1ml상층액을 새 E-tube에 옮긴다.
9) 1vol의 chloroform넣고 잘 흔들어 섞는다.
10) 12000rpm 3분간 원심분리 950[mu]l 상층액을 조심스럽게 옮긴다.
11) 1vol의 isopropanol 넣고 상온에서 30분간 둔다.
12) 12000rpm 15분간 원심분리 후 침전물을 70%EtOH 1ml로 씻는다.
13) TEN buffer 500[mu]l (50[mu]g/ml RNase녹인)에 침전물을 녹인다.
14) 37도 , 30min 둔다.
15) phenol/chloroform추출
16) 100% EtOH 침전한다. 침전물을 70%EtOH 1ml로 씻는다.
17) 50[mu]l TE(pH8.0)에 녹인다.
