cDNA란, complementary DNA의 약자로, 상보적 DNA라고 합니다. 이는 mRNA(전령 RNA)로부터 역전사 효소(reverse transcriptase)를 이용해 합성한 DNA입니다.
DNA는 두 종류(단백질 합성 코드를 가지고 있는 엑손(exon), 가지고 있지 않은 인트론(intron))의 서열로 이루어져 있는데, cDNA는 인트론(intron)이 존재하지 않는 DNA서열입니다.
즉, 단백질 합성에 필요한 정보만을 가진 DNA서열입니다.
왜 cDNA를 만들까?
mRNA는 세포에서 단백질을 만들기 위한 유전 정보만을 포함하고 있지만, RNA는 불안정하고 실험에 사용하기 어려워서, 안정적인 형태의DNA로 바꾸어 사용합니다. 바로 이때 만드는 것이 cDNA입니다.
ice, PCR machine(70℃ 6m, 42℃ 1h, 72℃ 15m, 4℃ setting)
Promega
- M-MLV 5x Rx bo, dNTP, RNase Inhibiter, M-MLVRT(enzyme)
TAKARA
- DNase, 10xDNase bo
PCR tube 사용
1. DNase 처리 RNA(1~5mg), RNA 2mg으로 맞춰서 시행
DEPC-Dw : 8,9ul (DEPC + RNA 2ug)
10xDNase bo : 1.1ul
DNase : 1ul
total : 11ul
→ 37℃ at 1hr
(80℃ at 10min TAKARA DNase) 활성을 없애기 위해서 → ice
2. cDNA synthesis
DNase 처리한 RNA
Oligo dT : 1ul
DEPC-Dw : total 맞춤
total : 12ul
→PCR machine으로 맞춤
→ 70℃ at 5min
→ ice 5min ← 온도 down
M-MLV 5x Rx bo : 5ul(주황)
dNTP : 1.3ul(상아)
RNase Inhibiter : 0.6ul(Takara RRⅠ)
M-MLVRT(enzyme) : 1ul(주황)
Dw : 5.1
total : 13
전체 total : 25ul
넣어줌
→ 42℃ at 1hr
→ 72℃ at 15min
→ 끝난 후 primer로 PCR해서 확인
RNase free water로 dilution
희석해서 RT-PCR or qRT-PCR 수행할 시
Efficiency curve test 수행할 것
(최초 cDNA를 2배씩 희성해거 Ct value가 안정적으로 1이 나오는 dilution factor range를 찾는 실험)
64배까지 희석해서 쓰는데 아무 문제가 없었다는 의견도 있음
그러나 cDNA를 dilution하면 파이펫 에러가 크게 작용하여 Ct변과가 크게 나옴.