효능 평가 - ABTS assay에 의한 항산화활성 평가

효능 평가 - ABTS assay에 의한 항산화활성 평가

 

https://www.protocols.io/view/abts-decolorization-assay-in-vitro-antioxidant-cap-14egnxk86l5d/v1?step=9 참고

ABTS decolorization assay – in vitro antioxidant capacity

 

 

시약

2,2-azino-bis (3-ethyl-benthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS, C18H24N6O6S4, MW548.68)(실온)

Potassium Persulfate, 과황산칼륨(K2S2O8, MW270.32)(실온)

 

표준물질

L-Ascorbic acid

MW: 176.12, solvent: DW

BHA(Butylated hydroxyanisole)

MW: 180.24, solvent: EtOH

BHT(Butylated hydroxytoluene)

MW: 220.35, solvent: EtOH

 

실험방법

ABTS solution 최종 7mM ABTS, 2.45mM Ammonium persulfate(APS) 1:1로 섞음

1. 14mM ABTS solution 준비

1) (10mg ABTS tablet 사용시: sigma A9941, MW548.68): 1개의 tablet을 1.3ml DW에 녹임

2) (powder 사용시: sigma A1888): 7.7mg(정확히는 7.68mg)을 1ml DW에 녹임(tablet보다 훨씬 진한듯)

※ tablet 사용시 사용은 용이하나 값이 비쌈(20배이상).

2. 4.9mM Ammonium persulfate(APS) solution 준비(sigma A3678, MW228.2)

- 11.2mg(정확히는 11.1818mg)을 10ml DW에 녹임

 

3. ABTS solution과 APS를 1:1로 섞는다.

ABTS solution(APS 전)

ABTS* solution(APS 추가)

 

4. 상온에서 12~16시간 암반응 시킨다.

ABTS* solution O/N,  상온

 

5. OD734nm에서 ABTS radical stock solution을 확인함

Ex) 10ul ABTS* solution을 최종 용량 1000ul로 희석하여 OD734nm확인

 

6. ABTS stock 준비(OD734nm에서 0.7)
Ex)이전 단계에서 준비한 용액이 0.689일 경우 ABTS*stock 은 100ul 에 9842.9ul로 희석함

분석시 190ul 필요

제조한 용액이 0.805일 경우 1.15배를 희석하여 0.7으로 만듬

ABTS solution(734nm 에서  0.7)

 

ABTS decolorization assay

1. PBS(or other solvent) 10ul와 DW190

2. 표준물질(L-ascorbic acid, Trolox, BHA, BHT)를 0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, 800mg 로 만듬
※ascorbic acid의 stock 농도는 1mg/ml, 100ug/ml으로 만들어 희석해서 분주)

5, 10, 20, 50, 100, 200, 1000ug/ml 농도 사용. IC50은 9-15정도임

5-100ug/ml 농도로 사용하였음. 100ug/ml의 경우 저해활성값이 50-60정도임

3. sample 10ul 과 ABTS stock 190 넣음

4. 암조건에서 5분간 반응한 후 734nm에서 측정

 

Trolox  농도별의  ABTS  반응

 

 계산

Trolox standard solutions.

 

Trolox  검량선

 

 

방정식을 사용하여 trolox의 항산화 능력에 대한 샘플의 항산화 능력을 계산함

Ex)