미세조류 Chlamydomonas rainhardtii 의 DNA 추출하는 방법이다.
시약
SDS-EB buffer(2%SDS, 400mM NaCl, 50mM EDTA, 100mM Tris-HCl pH8.0)
PCI(25:24:1, phenol:chloroform:isoamylalcohol), pH8.0 (주)바이오세상
100% EtOH, 70% EtOH
TE buffer
RNaseA(20mg/ml, Invitrogen, 12091021)
1. 배양한 cell 중, 1x10^7 cells ~ 2 x 10^7 cells 사용
2. Resuspend cells in 200ul of H2O, add 400ul of SDS-EB buffer, and vortex to mix.
200ul H2O 넣은 후 400ul SDS-EB bo 넣고 vortex 다 풀어줌(cell이 녹아 늘어짐)
3. Extract twice with 600ul phenol/chloroform(1:1) for few min by vortexing, (if high molecular weight DNA is desired mix gently by inversion), separate phases by centrifugation for 5min. transfer aq. phase to a new tube.
600ul phenol/chloroform(1:1)[PCI(25:24:1phenol:chloroform:isoamylalcohol), pH8.0 (주)바이오세상] 넣음. 손으로 강하게 inversion 과 vortexing 3min, centri 5min 상등액 new tube x2반복(찌꺼기가 잘 딸려 올라옴 팁 끝에 잘라냄)
4. Extract once with 300ul chloroform, transfer aq. to a new tube.
300ul chloroform vortexing 3min, centri 5min 상등액 new tube x2반복
5. Add 2 volumes abs. 100% ethanol, incubate at RT for 10~15min., centrifuge for 20min at maximum speed.
2vol 100% EtOH or 동일vol isopropanol 냉동고에 넣어두면 더 좋음
6. Wash the pellet twice with 500ul of 70% ethanol. Air dry the pellet and resuspend in 20~40ul of TE+RNase
70% EtOH 미리 만들어 냉동고에 넣어두기. 1ml tip으로 딴후 10ul tip으로 다시 땀.
TE 250ul + RNaseA(20mg/ml) 6ul 실험실에 있는거는 10mg/ml 12ul으로 넣어야함
7. DNA가 잘 추출됐는지 확인(nanodrop & gel loading)
